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Ciclo di Krebs

Il ciclo di Krebs (anche detto ciclo degli acidi tricarbossilici o ciclo dell’acido citrico) è un  ciclo metabolico  di importanza fondamentale in tutte le  cellule  che utilizzano  ossigeno  nel processo della  respirazione cellulare. In questi  lt organismi   aerobici, il ciclo di Krebs è l’anello di congiunzione delle  vie metaboliche  responsabili della degradazione (catabolismo) dei  carboidrati, dei  grassi  e delle  proteine  in  anidride carbonica  e  acqua  con la formazione di energia chimica. Il ciclo di Krebs è una via metabolica  anfibolica, poiché partecipa sia a processi  catabolici  che  anabolici. Il ciclo fornisce infatti anche molti precursori per la produzione di alcuni  amminoacidi (ad esempio l’α-chetoglutarato  e l’ ossalacetato) e di altre  molecole  fondamentali per la  cellula. Il ciclo è così denominato in onore dello scienziato anglo-tedesco Sir  Hans Adolf Krebs, che propose nel  1937  gli elementi chiave della via metabolica. Per questa scoperta ricevette nel  1953  il  Premio Nobel per la medicina.

Cenni generali
Il ciclo di Krebs avviene nei mitocondri delle cellule eucariote e nel citoplasma delle cellule procariote. Il catabolismi glucidico e lipidico (attraverso la glicolisi e la beta ossidazione), producono acetil-CoA, un gruppo acetile legato al coenzima A. L’acetil-CoA costituisce il principale substrato del ciclo. Il suo ingresso consiste in una condensazione con ossalacetato, a generare citrato. Al termine del ciclo stesso, i due atomi di carbonio immessi dall’acetil-CoA verranno ossidati in due molecole di CO 2, rigenerando nuovamente ossalacetato in grado di condensare con acetil-CoA. La produzione rilevante dal punto di vista energetico, tuttavia, è quella di una molecola di GTP (immediatamente utilizzata per rigenerare una molecola di ATP), di tre molecole di NADH ed una di FADH2.
I cofattori ridotti (NADH e FADH 2), si comportano come intermedi ossido/riduttivi. Quando ridotti, essi sono in grado di trasportare lt elettroni ad energia relativamente alta (sottratti ai substrati ossidati ad esempio nella glicolisi o nello stesso ciclo di Krebs) fino alla catena respiratoria mitocondriale. Presso tale catena, essi vengono riossidati (a NAD + e FAD) e cedono gli elettroni alla catena stessa, che sarà così in grado di rigenerare molecole di ATP da ADP. La reazione netta è la seguente:

acetil-CoA + 3 NAD + + FAD + ADP + P i → CoA + 3 NADH + H + + FADH 2 + ATP + 2 CO 2

L’energia che si ricava dalla completa demolizione di una molecola di glucosio attraverso i tre diversi stadi della respirazione cellulare (glicolisi, ciclo di Krebs e catena di trasporto di elettroni), è idealmente di 36 molecole di ATP. In realtà sono 38 le molecole nette di ATP ad essere prodotte, ma 2 di esse vengono consumate per trasportare (tramite lt trasporto attivo) dal citoplasma alla matrice mitocondriale le 2 molecole di NADH prodotte nella glicolisi.

Substrato Coenzimi Enzima Tipo di reazione Inibitori Attivatori Prodotto
1 Ossalacetato Acetil-CoA, acqua Citrato sintasi Condensazione Citrato, NADH, Succinil-CoA Citrato
2a Citrato Aconitasi Deidratazione cisAconitato, acqua
2b cisAconitato Acqua Idratazione Isocitrato
3a Isocitrato NAD Isocitrato deidrogenasi Ossidazione NADH, ATP Ca 2+, ADP Ossalsuccinato, NADH
3b Ossalsuccinato H + Decarbossilazione α-chetoglutarato, CO2
4 Chetoglutarato NAD +, CoA-SH α-chetoglutarato deidrogenasi Decarbossilazione ossidativa NADH, Succinil-CoA Ca 2+ Succinil-CoA, NADH, CO 2
5 Succinil-CoA GDP, Fosfato Succinil-CoA sintetasi Trasferimento di fosfato Succinato, GTP, CoA-SH
6 Succinato FAD Succinato deidrogenasi Ossidazione Fumarato, FADH 2
7 Fumarato Acqua Fumarasi Idratazione L-Malato
8 L-Malato NAD + Malato deidrogenasi Ossidazione Ossalacetato, NADH
Tappe del ciclo di Krebs
Reazione 1: Citrato Sintasi

ΔG’°=-31.4 kJ/mole

La  citrato sintasi catalizza la  condensazione  dell’ ossalacetato con  acetil-CoA, ad ottenere  citrato. La sua  lt struttura quaternaria  consta di due subunità, ad ognuna delle quali si possono legare i due substrati. Il sito attivo dell’enzima attiva l’acetil-CoA per renderlo affine ad un centro carbonioso dell’ossalacetato. In seguito al legame tra le due molecole, il gruppo tioestere (CoA) viene lt idrolizzato, formando così la molecola di citrato. La reazione è altamente esoergonica (ΔG’°=-31.4 kJ/mole), motivo per cui questo step è irreversibile.

Il citrato prodotto dall’enzima, inoltre, è in grado di  inibire competitivamente l’attività dell’enzima. Pur essendo la reazione molto favorita (perché esoergonica), dunque, la citrato sintasi può essere saldamente regolata. Questo aspetto ha una notevole importanza biologica, dal momento che permette una completa regolazione dell’intero ciclo di Krebs, rendendo l’enzima una sorta di pacemaker dell’intero ciclo.

Reazione 2: Aconitasi

ΔG’°=+6.3 kJ/mole

La  aconitasi catalizza la  isomerizzazione del  citrato ad  lt isocitrato  (attraverso la formazione di cisaconitato ). L’enzima catalizza anche la reazione inversa, ma nel ciclo di Krebs tale reazione è unidirezionale a causa della  legge di azione di massa : le concentrazioni (in  condizioni standard ) di citrato (91%), dell’intermedio cisaconitato (3%) e di isocitrato (6%), infatti, spingono la reazione decisamente verso la produzione di isocitrato.

Nel sito attivo dell’enzima è presente un cluster ferro-zolfo (chiamato  cubano ) che, insieme ad alcuni residui amminoacidici polari, lega il substrato. Più nel dettaglio, il legame al substrato viene assicurato dalla presenza di un residuo di  serina , di  lt arginina , di istidina  e di  lt aspartato, che permettono il legame stereospecifico del solo citrato 1R,2S, respingendone la forma opposta.

Reazione 3: isocitrato deidrogenasi

G’°=-8.4 kJ/mol

La isocitrato deidrogenasi mitocondriale è un enzima dipendente dalla presenza di NAD+ e di Mn2+ e/o Mg2+. Inizialmente, l’enzima catalizza l’ossidazione dell’isocitrato ad ossalsuccinato, che genera una molecola di NADH a partire da NAD+. Successivamente, la presenza di uno ione bivalente che complessa gli ossigeni del gruppo carbossile in posizione alfa aumenta l’elettronegatività di quella regione di molecola.

Ciò genera un riarrangiamento degli elettroni della molecola, con conseguente rottura del legame tra il carbonio in posizione gamma e l’adiacente gruppo carbossile. In questo modo si ha dunque una decarbossilazione (ossia l’uscita di una molecola di CO2), che porta alla formazione di α-chetoglutarato, caratterizzato da due carbossili alle estremità e da un chetone in posizione alfa rispetto ad uno dei due gruppi carbossilici.

Reazione 4: α-chetoglutarato deidrogenasi

ΔG’°=-30.1 kJ/mole

La conversione dell’isocitrato in α-chetoglutarato è seguita da una seconda reazione di decarbossilazione ossidativa, che porta alla formazione di succinil CoA. La decarbossilazione ossidativa dell’α-chetoglutarato è molto simile a quella del piruvato, un altro α-chetoacido. Entrambe le reazioni includono infatti la decarbossilazione di un α-chetoacido e la conseguente produzione di un legame tioestere ad alta energia con il coenzima A. I complessi che catalizzano tali reazioni sono simili tra loro.

La α-chetoglutarato deidrogenasi (più correttamente detta ossoglutarato deidrogenasi) è infatti composta di tre enzimi differenti. La subunità E1, detta 2-chetoglutarato deidrogenasi, e la E2, detta transsuccinilasi, presentano un’estrema omologia con quelle della piruvato deidrogenasi. La subunità E3, la diidrolipoamide deidrogenasi, invece, è lo stesso polipeptide presente nell’altro complesso enzimatico.
Reazione 5: Succinil-CoA Sintetasi
ΔG°′ = –3.3 kJ mol-1 Il  succinil-CoA è un  tioestere ad alta energia (la sua ΔG°′ di idrolisi  è di circa –33.5 kJ mol –1, simile a quella dell’ATP, di –30.5 kJ mol –1). La  citrato sintasi si serve di un intermedio avente tale legame ad alta energia per portare a termine la fusione tra una molecola a due atomi di  carbonio  ( acetil-CoA) ed una a quattro ( ossalacetato). L’enzima  succinil-CoA sintetasi si serve invece di tale energia per  fosforilare un  lt nucleoside  difosfato  purinico  come il  lt GDP . L’energia proveniente dal tioestere viene semplicemente convertita in energia legata ad un  legame fosfato . Il primo passaggio della reazione genera un nuovo intermedio ad alta energia, noto come succinil fosfato.
Successivamente, una  istidina  presente nel sito catalitico rimuove il fosfato dalla molecola glucidica, generando il prodotto  succinato ed una molecola di fosfoistidina, che dona velocemente il fosfato ad un nucleoside difosfato, ricaricandolo a trifosfato. Si tratta dell’unico passaggio del ciclo in cui si ha una  fosforilazione al livello del substrato. Il  GTP  è principalmente coinvolto nei pathway di  trasduzione del segnale : il suo ruolo in un processo energetico come il ciclo di Krebs è invece essenzialmente quello ditramite per il trasferimento di gruppi fosfato verso l’ATP, in una reazione catalizzata dalla  nucleoside difosfochinasi.
Reazione 6: Succinato Deidrogenasi
ΔG’°=0 kJ/mole

La parte finale del ciclo vede il riarrangiamento di molecole a quattro atomi di carbonio fino alla rigenerazione dell’ossalacetato. Perché ciò sia possibile, il gruppo metile presente sul succinato deve essere convertito in un carbonile. Come avviene in altri pathways (ad esempio la beta ossidazione degli acidi grassi), tale conversione avviene attraverso tre passaggi: una prima ossidazione, una idratazione ed una seconda ossidazione. Questi tre passaggi, oltre a rigenerare ossalacetato, permettono l’estrazione di ulteriore energia attraverso la formazione di FADH2 e NADH.

La prima reazione di ossidazione è catalizzata dal complesso della succinato deidrogenasi, l’unico enzima del ciclo ad avere come accettore di idrogeno il FAD anziché il NAD+: il FAD è legato in modo covalente all’enzima, attraverso un residuo di istidina. L’enzima si serve del FAD poiché l’energia associata alla reazione non è sufficiente per ridurre NAD+. Il complesso enzimatico è anche l’unico del ciclo ad essere annidato all’interno della membrana mitocondriale. Tale posizione è dovuta anche al coinvolgimento dell’enzima nella catena di trasporto degli elettroni (dove è definito complesso II). Gli elettroni passati sul FAD vengono dunque immessi direttamente nella catena, grazie al legame stabile tra l’enzima ed il cofattore stesso.

Reazione 7: Fumarasi
ΔG’°=-3.8 kJ/mole

La fumarasi catalizza l’aggiunta in trans di un protone e di un gruppo OH- provenienti da una molecola d’acqua. Dal momento che l’enzima è in grado di legare OH- solo da un lato, il fumarato può essere convertito solo in L-malato

Reazione 8: malato deidrogenasi
ΔG’°=+29.7 kJ/mole

L’ultima reazione del ciclo consiste nell’ossidazione del  malato ad  ossalacetato. La reazione, catalizzata dalla  malato deidrogenasi , utilizza un’altra molecola di  NAD + come accettore di  idrogeno  (producendo  NADH). L’ energia libera di Gibbs  associata a quest’ultima reazione è decisamente positiva (a differenza delle altre del ciclo). L’attività dell’enzima ètrainata dal consumo di ossalacetato da parte della  citrato sintasi e di NADH da parte della  catena di trasporto degli elettroni.

Regolazione del ciclo
La velocità del ciclo di Krebs viene continuamente modulata per venire incontro alle esatte necessità energetiche della cellula. I siti primari di controllo sono gli enzimi allosterici, la isocitrato deidrogenasi e la α-chetoglutarato deidrogenasi. La isocitrato deidrogenasi è stimolata allostericamente dalla presenza di ADP, che aumenta l’affinità dell’enzima per il substrato. I legami di isocitrato, di NAD +, di Mg 2+, e di ADP all’enzima sono mutuamente cooperativi in senso attivatore. Al contrario, il NADH inibisce l’enzima attraverso lo spiazzamento diretto di NAD +. Lo stesso ATP ha effetto inibitorio. Il secondo sito di controllo del ciclo è posto presso la α-chetoglutarato deidrogenasi. Alcuni aspetti del controllo di questo enzima sono simili a quelli del complesso della piruvato deidrogenasi, come ci si può attendere dall’estrema omologia presente tra i due enzimi. La α-chetoglutarato deidrogenasi è dunque inibita dal succinil CoA e dal NADH, i prodotti della reazione che catalizza. La α-chetoglutarato deidrogenasi può anche essere inibita genericamente da un alto livello energetico presente nella cellula. Ciò significa che, in presenza di alti livelli di ATP, la cellula è in grado di ridurre l’efficienza del processo di produzione di energia, all’interno del quale il ciclo di Krebs ha una posizione centrale. In molti batteri, è controllato anche l’ingresso nel ciclo delle molecole a due atomi di carbonio. In essi, la sintesi di citrato da ossalacetato ed acetil CoA è la sede di un’importante regolazione. L’ATP, infatti, è un inibitore allosterico della citrato sintasi. L’effetto concreto dell’ATP è quello di aumentare la KM dell’enzima per l’acetil CoA. In questo modo, più ATP è presente nella cellula, meno Acetil CoA viene immesso nel ciclo.

Interazioni tra ciclo di Krebs ed altre vie metaboliche
Il ciclo di Krebs occupa una posizione centrale nel metabolismo dei viventi, ricoprendo un ruolo chiave soprattutto nelle vie cataboliche.

A monte del ciclo di Krebs
Il ciclo di Krebs è infatti il secondo stadio del catabolismo dei carboidrati. La glicolisi degrada il lt glucosio (ed altre molecole a sei atomi di carbonio) in piruvato (un α-chetoacido contenente tre atomi di carbonio). Neglieucarioti il piruvato è trasferito dal citoplasma (sede della glicolisi) nei mitocondri dove perde un atomo di carbonio e viene convertito in acetil-CoA dalla piruvato deidrogenasi (lt decarbossilazione ossidativa del piruvato). All’interno del mitocondrio, l’acetil-CoA può entrare nel ciclo di Krebs, come precedentemente descritto. Per quanto riguarda le proteine, esse vengono degradate con meccanismi detti di proteolisi attraverso enzimi detti proteasi, che le spezzettano nei costituenti fondamentali: gli amminoacidi. Alcuni amminoacidi possono costituire una fonte di energia, poiché sono convertibili in alcuni intermedi del ciclo stesso (ad esempio aspartato, valina ed isoleucina). Altri, convertibili in molecole glucidiche, possono entrare nel ciclo passando per le vie cataboliche tipiche dei glucidi (ad esempio l’alanina, convertibile in lt piruvato). Nel catabolismo lipidico, i trigliceridi sono idrolizzati da enzimi detti lipasi per formare acidi grassi e lt glicerolo. Negli organismi superiori, il glicerolo può entrare nella glicolisi a livello epatico o essere trasformato in glucosio attraverso il diidrossiacetone fosfato e la gliceraldeide-3-fosfato seguendo la via metabolica della lt gluconeogenesi. In molti tessuti, specialmente nel cuore, gli acidi grassi sono degradati attraverso un processo noto come lt beta-ossidazione, che produce acetil-CoA, a sua volta internalizzato nel ciclo di Krebs. La beta-ossidazione può anche generare lt propionil-CoA, che a sua volta può essere reimmesso nella via gluconeogenetica epatica a generare glucosio.

A valle del ciclo di Krebs
Il ciclo di Krebs è sempre seguito dalla fosforilazione ossidativa, una catena di trasporto di elettroni. L’una non avrebbe senso senza l’altra in quanto l’ATP e il GTP prodotto dal ciclo in sé è scarso e la produzione di NADH e FADH 2 porterebbe ad un ambiente mitocondriale eccessivamente ridotto, mentre la sola catena respiratoria necessiterebbe di una fonte di cofattori ridotti pena l’ossidazione dell’ambiente. Questarespirazione cellulare estrae energia da NADH e FADH 2, ricreando NAD + e FAD, permettendo in tal modo al ciclo di continuare. Il ciclo di Krebs non usa lt ossigeno, che è invece utilizzato nella fosforilazione ossidativa.

Reazioni in cui sono coinvolti gli intermedi del ciclo
Gli intermedi del ciclo di Krebs sono implicati in numerosi altri pathway metabolici. Di seguito, vengono elencati in modo sommario i pathway in cui sono coinvolti i metaboliti del ciclo.[9]Acetil CoA:

  • beta ossidazione;
  • biosintesi degli acidi grassi;
  • degradazione della lisina;
  • degradazione di valina ed isoleucina;
  • metabolismo della fenilalanina.

α-chetoglutarato:

  • biosintesi della lisina;
  • metabolismo dell’acido ascorbico;
  • metabolismo del glutammato.

Succinil CoA:

  • metabolismo del  propanoato;
  • sintesi delle  porfirine;
  • degradazione di leucina ed isoleucina;
  • metabolismo della fenilalanina.

Succinato:

  • metabolismo del  butanoato;
  • metabolismo della tirosina.

Fumarato:

  • ciclo dell’urea;
  • metabolismo dell’arginina e della prolina;
  • metabolismo della tirosina.

Ossalacetato:

  • metabolismo del  gliossilato;
  • metabolismo del glutammato e dell’ aspartato;
  • gluconeogenesi.

Il ciclo del gliossilato
Molte piante e batteri sono in grado di crescere in terreni contenenti acetato o altri composti convertibili in acetil CoA. Essi si servono di un pathway assente nella maggior parte dei viventi, noto come ciclo del gliossilato. Attraverso tale ciclo, infatti, essi sono in grado di convertire molecole a due atomi di carbonio (come l’acetile) nelle molecole a quattro atomi di carbonio (in particolare il succinato) necessarie per la produzione di energia attraverso il ciclo di Krebs, nonché per i numerosi processi biosintetici in cui esso è coinvolto. Il risultato netto del ciclo del gliossalato è il seguente:

2 acetil CoA + 2 NAD + + FAD → ossalacetato + 2 CoA + FADH 2 + 2 H +

Note

  • C. Usher, J. Remington, P. Martin, G. Drueckhammer, A very short hydrogen bond provides only moderate stabilization of an enzyme-inhibitor complex of citrate synthase. In: Biochemistry 33, S. 7753-7759, 1994
  • Lauble, C. D. Stout: Steric and conformational features of the aconitase mechanism. In: Proteins 22, S. 1-11, 1995
  • Mesecar, A.D., Stoddard, B.L., Koshland Jr., D.E. Orbital steering in the catalytic power of enzymes: small structural changes with large catalytic consequences. Science v277 pp.202-206, 1997
  • Knapp, J.E., Carroll, D., Lawson, J.E., Ernst, S.R., Reed, L.J., Hackert, M.L. Expression, purification, and structural analysis of the trimeric form of the catalytic domain of the Escherichia coli dihydrolipoamide succinyltransferase. Protein Sci. v9 pp.37-48, 2000
  • Fraser, M.E., James, M.N., Bridger, W.A., Wolodko, W.T. Phosphorylated and dephosphorylated structures of pig heart, GTP-specific succinyl-CoA synthetase. J.Mol.Biol. v299 pp.1325-1339, 2000
  • V. Yankovskaya, R. Horsefield, S. Tornroth, C. Luna-Chavez, H. Miyoshi, C. Leger, B. Byrne, G. Cecchini, S. Iwata: Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygen species generation. In: Science 299, S. 700-704, 2003
  • Weaver, T., Lees, M., Zaitsev, V., Zaitseva, I., Duke, E., Lindley, P., McSweeny, S., Svensson, A., Keruchenko, J., Keruchenko, I., Gladilin, K., Banaszak, L. Crystal structures of native and recombinant yeast fumarase. J.Mol.Biol. v280 pp.431-442, 1998
  • Tomita, T., Fushinobu, S., Kuzuyama, T., Nishiyama, M. Structural basis for alteration of cofactor specificity of malate dehydrogenase from Thermus flavus
  • Interconnessioni del ciclo di Krebs con altri pathways cellulari (fonte:  KEGG)